糖原合成酶（GCS）测定试剂盒（微量法）

测定原理：                                                           

GCS催化UDPG和葡萄糖残基生成糖原和UDP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD⁺，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映GCS活性。

需自备的仪器和用品：                                                

分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：                                                       

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体18 mL×1瓶， 4℃保存；

试剂二：液体2.5mL×1瓶，4℃保存；

试剂三：液体16.4uL×1支，4℃保存；

试剂四：粉剂×1支， -20℃保存；

试剂五：粉剂×1支， -20℃保存；

样本的前处理：                                                         

按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：                                                           

1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 工作液的配制：临用前将试剂三和试剂四转移到试剂一中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

3、  试剂五的配制：临用前在试剂五中加入1mL试剂二充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

4、  将工作液和试剂五置于37℃预热5分钟。

5、  在1mL微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂五和180μL工作液，立即混匀，记录340nm处初始吸光值A1和1min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

注意：在该试剂盒中，若ΔA大于0.1，需将样本用提取液稀释适当倍数后测定，使ΔA小于0.1可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。

GCS活性计算：                                                        

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GCS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位定义：每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GCS（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T=3215×ΔA÷W

V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。

b.用96孔板测定的计算公式如下

（1）按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GCS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位定义：每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GCS（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T=6430×ΔA÷W

V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。