淀粉含量测定试剂盒（微量法）

需自备的仪器和用品：                                                 

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰、浓硫酸（不允许快递）和蒸馏水。

试剂的组成和配制：                                                   

试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：液体105mL×1瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；

淀粉提取：                                                            

1、  称取0.1~0.2g新鲜样本（建议称取约0.1g新鲜样本）于研钵中研碎，加入1mL试剂一，充分匀浆后转移到EP管中，80℃水浴提取30min，3000g，25℃离心5min，弃上清，留沉淀。

2、  沉淀中加入0.5mL蒸馏水，放入95℃水浴中糊化15min（盖紧，以防止水分散失）。

3、  冷却后，加入0.35mL试剂二，25℃常温提取15min，振荡3-5次。

4、  加入0.85mL蒸馏水，混匀，3000g，25℃离心10min，取上清液待测。

注意：如样本为淀粉含量较高的干样，为保证充分提取，可适当减小取样量，如称取0.01g~0.02g干样，加入1mL试剂一，其余提取步骤同上。

测定步骤：                                                                

1、  分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至620nm，蒸馏水调零。

2、  调节水浴锅至95度。

3、工作液的配制：临用前在试剂三中加入3.75mL蒸馏水后，缓慢加入21.25mL浓硫酸，不断搅拌，充分溶解，待用；用不完的试剂4℃保存一周；

4、样本测定：取50μL样本和250μL工作液至EP管中，95度水浴10 min（盖紧，防止水分散失），自然冷却至室温，取200uL至微量石英比色皿或96孔板中，在620 nm 波长下记录测定吸光度值A。

淀粉含量计算：                                                       

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准条件下测定的回归方程为y = 5.872x - 0.0295；x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。

1、按照蛋白浓度计算

淀粉含量(mg/mg prot)=[(A+0.0295)×V1]÷5.872 ÷(V1×Cpr)=0.17×(A+0.0295) ÷Cpr

2、按样本鲜重计算

淀粉含量(mg/g 鲜重)= [(A+0.0295)×V1] ÷5.872÷(W×V1÷V2) =0.289×(A+0.0295) ÷W

V1：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V2：加入提取液体积，1.7 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准条件下测定的回归方程为y = 2.936x - 0.0295；x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。

1、按照蛋白浓度计算

淀粉含量(mg/mg prot)=[(A+0.0295)×V1]÷2.936 ÷(V1×Cpr)=0.34×(A+0.0295) ÷Cpr

2、按样本鲜重计算

淀粉含量(mg/g 鲜重)=[(A+0.0295)×V1]÷2.936÷(W×V1÷V2) =0.578×(A+0.0295) ÷W

V1：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V2：加入提取液体积，1.7 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g

注意：                                                               

1.由于工作液具有强腐蚀性，请谨慎操作。

2.若吸光值大于1，请将样本用提取液稀释后再测定，计算公式中乘以相应的稀释倍数。

3.提取液的配置：0.35mL试剂二+1.35mL水。用多少按照此比例配多少。

4.最低检测限为10μg/g鲜重或100ng/mgprot。