一.辅助试剂和器材准备
1) 37℃恒温箱。
2) 标准规格酶标仪。
3) 精密移液器及一次性吸头
4) 双蒸水或超纯水
5) 干净的试管或Eppendof管
6) 吸水纸
7) 自动洗板机或8道排枪
8) ELISA数据处理软件，推荐使用ELISACalc
9) 500ml烧杯的和适当量程的量筒
二.试剂盒中试剂配置
1) 使用前所有试剂应置于室温平衡至少30分钟。
2) 本试剂盒可以直接加样，如浓度过高，可以进行适当比例的稀释（推荐2-5倍稀释），计算时应将结果乘以稀释的倍数。
3) 洗涤液为25倍浓缩液，使用前将所有洗涤液倒入500ml或1L的烧杯中，用双蒸水定容到500ml即为工作液。
4) 标准品的稀释：先用标准品/样品稀释液将标准品冻干粉定容到150μl，然后漩涡混匀30秒即为标准品原液（24小时内用完）。取5支干净的Eppendorf管，每管加150μl的标准品稀释液，分别标记上
S1,S2,S3,S4,S5 .取150μl标准品原液加入标记S1 的管中，混匀后同样取出150μl，加入下一管，以此类推直至最后一管。零孔(S0)：直接加标准品/样品稀释液。（见下图）
标准原液 S1 S2 S3 S4 S5 S0
5) 生物素抗原的稀释：抽取生物素抗原稀释液1ml到浓缩型生物素抗原中，漩涡混匀15秒至冻干粉完全溶解，然后将所有液体移入稀释液瓶中,再次漩涡混匀30秒即为生物素抗原工作液。
6) 亲和素-HRP的稀释：低速离心（使浓缩液全部沉到管底），将浓缩亲和素-HRP全部移入相应稀释液中然后漩涡混匀30秒即为亲和素-HRP工作液。
三.洗板方法
1) 手工洗板：先洗去酶标孔中的的液体，在吸水纸上拍干，然后每孔加入300μl稀释好的洗涤液，轻轻摇晃30秒，然后甩掉，在吸水纸上拍干，重复4-5次。
2) 洗板机洗板：洗板机洗板比较便捷，但应操作熟练后使用。
四.详细操作程序
1) 使用前请先将试剂盒在室温下平衡半小时。
2) 空白孔不加样，只加显色剂A，B和终止液用于调零。
3) 标准品孔：每孔加入稀释好的标准品50μl，零孔加入标准品/样品稀释液50μl，然后加入生物素抗原工作液50μl(零孔必须要做，并将其作为标曲的最后一个点)。
4) 样品孔：加入样品50μl（推荐直接加样，浓度高可以用样品稀释液稀释2-5倍），然后加入生物素抗原工作液50μl。
5) 轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30min。
6) 将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水25倍稀释后备用。
7) 第一次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
8) 加入50μl亲和素-HRP到标准品孔和样品孔中，轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30min。
9) 第二次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
10) 显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。
11) 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色).
12) 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。
13) 计算：根据浓度和OD值算出标准曲线的回归方程，建议用专用计算软件进行计算，推荐使用ELISAcalc进行计算，拟合模型选用logistic曲线（四参数）。