氨基酸含量测定试剂盒（微量法） 100T/96S 150

自备仪器及用品：                                                     

台式离心机、水浴锅、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵、无水乙醇、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：                                                     

试剂一：液体×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1瓶（棕色），4℃避光保存。临用前加入667μL无水乙醇，盖紧后充分混匀，再加入9.333 mL蒸馏水混匀，避光保存。

试剂四：粉剂×1管，4℃避光保存。临用前加1 mL蒸馏水，充分溶解。

标准品：粉剂×1瓶，临用前加10 mL蒸馏水，充分溶解。1μmol/mL标准液，4℃避光保存。

样品中AA提取：                                                     

按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行室温匀浆，然后转移到1.5 mL EP 管中，盖紧后（防止水分散失）置于沸水浴提取15 min；自来水冷却后，8000g，，4℃离心10min，上清液置冰上待测。

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

血清等液体：直接检测。

测定操作：                                                             

1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到570 nm，蒸馏水调零。

2. 空白管：取EP管，加入10μL蒸馏水，100μL试剂二，100μL试剂三和10μL试剂四，混匀后盖紧瓶盖（防止水分散失），置于沸水浴中保温15 min，冷却后反复颠倒EP管数次，于570nm测定吸光值，记为A空白管。显色后务必在30min内测完。

3. 标准管：取EP管，加入10μL标准品，100μL试剂二，100μL试剂三和10μL试剂四，混匀后盖紧瓶盖（防止水分散失），置于沸水浴中保温15 min，冷却后反复颠倒EP管数次，于570nm测定吸光值，记为A标准管。显色后务必在30min内测完。

4. 测定管：取EP管，加入10μL上清液，100μL试剂二，100μL试剂三和10μL试剂四，混匀后盖紧瓶盖（防止水分散失），置于沸水浴中保温15 min，冷却后反复颠倒EP管数次，于570nm测定吸光值，记为A测定管。显色后务必在30min内测完。

注意：空白管和标准管只需要测定一次。

氨基酸含量计算公式：                                                   

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

氨基酸含量（μmol /mg prot）= [C标准品×V标准品×(A测定－A空白)÷(A标准－A空白)]÷（V样×Cpr）

=1×(A测定－A空白)÷(A标准－A空白) ÷Cpr

（2）按样本质量计算

氨基酸含量（μmol /g 鲜重）=[C标准品×V标准品×(A测定－A空白)÷(A标准－A空白)] ÷（V样总÷V样）÷W

=1×(A测定－A空白)÷(A标准－A空白) ÷W

（3）按细胞数量计算

氨基酸含量（μmol /10⁴ cell）=[C标准品×V标准品×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)] ×（V样总÷V样×细胞数量）

=1×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷细胞数量

（4）按照液体体积计算

氨基酸含量（μmol /mL）=[C标准品×V标准品×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]÷V样

=1×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)

C标准品：标准品浓度，1 μmol/mL；V标准品：反应体系中加入标准品体积，0.01 mL；W：样品质量，g；V样：反应体系中加入样品提取液体积，0.01 mL；V样总：样品提取液总体积，1mL；；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

氨基酸含量（μmol /mg prot）=[C标准品×V标准品×(A测定－A空白)÷(A标准－A空白)] ÷（V样×Cpr）

=1×(A测定－A空白)÷(A标准－A空白) ÷Cpr

（2）按样本质量计算

氨基酸含量（μmol /g 鲜重）=[C标准品×V标准品×(A测定－A空白)÷(A标准－A空白)]×（V样总÷V样）÷W

=1×(A测定－A空白)÷(A标准－A空白) ÷W

（3）按细胞数量计算

氨基酸含量（μmol /10⁴ cell）= [C标准品×V标准品×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)] ×（V样总÷V样×细胞数量）

=1×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷细胞数量

（4）按照液体体积计算

氨基酸含量（μmol /mL）=[C标准品×V标准品×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]÷V样

=1×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)

C标准品：标准品浓度，1 μmol/mL；V标准品：反应体系中加入标准品体积，0.01 mL；W：样品质量，g；V样：反应体系中加入样品提取液体积，0.01mL；V样总：样品提取液总体积，1mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL。

注意事项：                                                             

1. 试剂盒中试剂三、试剂四和标准品均需临用前配制，且避光保存，配制好未使用完的4℃保存且3天内使用完毕。

2. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于2.5），用蒸馏水稀释后再测定。

3. 脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应在570nm处无吸收峰，因此，570nm处测定结果不含这两种氨基酸的量。

4．最低检出限为100μmol/L。