果胶酶（pectinase）测定试剂盒(微量法)

自备实验用品及仪器                                                               

天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。

试剂组成和配制                                                                    

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体20mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×2瓶，4℃保存；临用前加入7.5mL试剂一，50℃加热溶解，用不完的试剂4℃保存一周。

试剂三：液体20mL×1瓶，4℃避光保存。

酶液提取                                                                          

1．组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2．细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。

3. 细胞培养液等：直接检测。

测定操作表                                                                          

酶活性计算公式                                                                    

a.       用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y = 3.9642x - 0.008；R² = 0.9996；x为标准品浓度，mg/mL；y为吸光值。

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：在50℃，pH3.5条件下，每毫克蛋白每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

果胶酶活性（mg/h/mg prot）= (ΔA+0.008) ÷3.9642×V反总÷（V样×Cpr）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：在50℃，pH3.5条件下，每克样本每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

果胶酶活性（mg/h /g 鲜重）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷W

3. 按细胞数量计算

酶活性定义：在50℃，pH3.5条件下，每10⁴细胞每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

果胶酶活性（mg/h /10⁴cell）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反总÷（V样×细胞数量÷V样总）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷细胞数量

4．细胞培养液

酶活性定义：在50℃，pH3.5条件下，每毫升培养液每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

果胶酶活性（mg/h /mL）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反总÷V样÷T=2.523×(ΔA+0.008)

V反总：反应总体积，0.15mL；V样：反应中样本体积，0.03mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，0.5h

b.       用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y = 1.9821x - 0.008，R² = 0.9996；x为标准品浓度，mg/mL；y为吸光值。

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：在50℃，pH3.5条件下，每毫克蛋白每小时分解果胶产。生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

果胶酶活性（mg/h/mg prot）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反总÷（V样×Cpr）÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：在50℃，pH3.5条件下，每克样本每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

果胶酶活性（mg/h/g 鲜重）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷W

3. 按细胞数量计算

酶活性定义：在50℃，pH3.5条件下，每10⁴细胞每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

果胶酶活性（mg/h /10⁴cell）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反总÷（V样×细胞数量÷V样总）÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷细胞数量

4．细胞培养液

酶活性定义：在50℃，pH3.5条件下，每毫升培养液每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

果胶酶活性（mg/h/mL）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反总÷V样÷T=5.045×(ΔA+0.008)

V反总：反应总体积，0.15mL；V样：反应中样本体积，0.03mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，0.5h

注意事项                                                                          

1.       试剂二若有沉淀析出，请置于50℃加热溶解。

2.       测定之前请先做预实验，如果吸光值较高或较低，请用提取液做适当的稀释或者加大样本量，并在计算公式中乘以稀释倍数或者以实际加入的样本体积参与计算。

3.       煮沸样本建议在沸水中煮沸10分钟，以将酶彻底灭活。