脱氢抗坏血酸（DHA）测定试剂盒（微量法）

自备仪器和用品：

低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体100 mL×1瓶，室温保存。

试剂二：液体16mL×1瓶，室温保存。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入5mL蒸馏水充分溶解。

标准品：粉剂×1瓶， 4℃保存。临用前加入5.743 mL蒸馏水充分溶解；吸取0.1 mL上述溶液，加入0.9 mL蒸馏水，混匀，即为100μmol/L DHA。

样品中DHA提取：

1.       组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心20min，取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；12000g，4℃离心10min，取上清液置于冰上待测。

3. 血清等液体：直接测定。

DHA测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到265 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二在25℃水浴锅中预热30 min。

3. 标准管：依次在微量石英比色皿/96孔板加入20μL标准液、160μL预热的试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后于265nm比色，记录10s和130s的吸光值A1和A2，△A空白管=A2-A1。

4. 测定管：依次在微量石英比色皿/96孔板加入20μL上清液、160μL预热的试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后于265nm比色，记录10s和130s的吸光值A3和A4，△A测定管=A4-A3。

注意：标准管只需测定一次。

计算公式：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

DHA(nmol/mg prot) =[C标准液×△A测定管÷△A标准管×V标准]÷（Cpr×V样）

=100×△A测定管÷△A标准管÷Cpr

(2). 按样本质量计算

DHA(nmol/g 鲜重) =[C标准液×△A测定管÷△A标准管×V标准]÷(W×V样÷V样总)

=100×△A测定管÷△A标准管÷W

(3). 按细胞数量计算

DHA(nmol/10⁴ cell) =[C标准液×△A测定管÷△A标准管×V标准]÷(W×V样÷V样总)

=100×△A测定管÷△A标准管÷细胞数量

（4）按液体体积计算

DHA(nmol/mL) =[C标准液×△A测定管÷△A标准管×V标准]÷V样

=100×△A测定管÷△A标准管

C标准液：100μmol/L；V样总：上清液总体积，1.0 mL=1 ×10^-3 L；V标准：加入标准品体积，0.02mL；V样：加入样本体积，0.02mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量（g）。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

DHA(nmol/mg prot) =[C标准液×△A测定管÷△A标准管×V标准]÷（Cpr×V样）

=100×△A测定管÷△A标准管÷Cpr

(2). 按样本质量计算

DHA(nmol/g 鲜重) =[C标准液×△A测定管÷△A标准管×V标准]÷(W×V样÷V样总)

=100×△A测定管÷△A标准管÷W

(3). 按细胞数量计算

DHA(nmol/10⁴ cell) =[C标准液×△A测定管÷△A标准管×V标准]÷(W×V样÷V样总)

=100×△A测定管÷△A标准管÷细胞数量

（4）按液体体积计算

DHA(nmol/mL) =[C标准液×△A测定管÷△A标准管×V标准]÷V样

=100×△A测定管÷△A标准管

C标准液：100μmol/L；V样总：上清液总体积，1.0 mL=1×10^-3 L；V标准：加入标准品体积，0.02mL；V样：加入样本体积，0.02mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量（g）。

注意事项：

1.       临用前配制的试剂未使用完的4℃保存，3天内使用完。

2.       最低检出限为10μmol/L。