自备仪器和用品:
研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液器和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体×1瓶,室温保存。
试剂二:液体×1瓶,4℃保存。
试剂三:粉剂×2瓶,-20℃保存,临用前每瓶加入9mL试剂二,现配现用。
试剂四:液体×1支,4℃保存。
粗酶液提取:
1、 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。16000g,4℃离心20min,取上清置冰上待测。
2、 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);16000g, 4℃离心20min,取上清液置冰上待测。
3、血清等液体:直接测定。
ADH测定操作:
1. 分光光度计/酶标仪预热30 min,调节波长到340 nm,蒸馏水调零。
2. 试剂三在25℃水浴中保温30 min。
3. 在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μL样本上清液、160μL试剂三和20μL试剂四,迅速混匀后于340nm测定吸光值变化,分别记录15s和75s时吸光值,分别记为A1和A2。△A测定管=A1-A2。
计算公式:
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1)按照蛋白浓度计算
活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。
ADH (nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反总×109)÷(Cpr×V样)÷T
=1608×△A ÷Cpr
(2)按照样本质量计算
活性单位定义:25℃中每克组织每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。
ADH (nmol/min/g 鲜重) =(△A÷ε÷d×V反总×109)÷(W×V样÷V样总)÷T
=1608×△A ÷W
(3)按细胞数量计算
活性单位定义:25℃中每104个细胞每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。
ADH (nmol/min/104cell) = (△A÷ε÷d×V反总×109) ÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
=1608×△A ÷细胞数量
(4)按液体体积计算
活性单位定义:25℃中每毫升血清每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。
ADH (nmol/min/mL) =(△A÷ε÷d×V反总×109) ÷V样÷T
=1608×△A
ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1 cm;V反总:反应体系总体积,200μL=2×10-4 L;Cpr:上清液蛋白质浓度,mg/mL;W :样品质量;V样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02 mL;V样总:提取液体积,1 mL;T:反应时间,1min。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
(1)按照蛋白浓度计算
活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。
ADH (nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反总×109) ÷(Cpr×V样)÷T
=3215×△A÷Cpr
(2)按照样本质量计算
活性单位定义:25℃中每克组织每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。
ADH (nmol/min/g 鲜重) =(△A÷ε÷d×V反总×109) ÷(W×V样÷V样总)÷T
=3215×△A÷W
(3)按细胞数量计算
活性单位定义:25℃中每104个细胞每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。
ADH (nmol/min/104cell) =(△A÷ε÷d×V反总×109) ÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
=3215×△A÷细胞数量
(4)按液体体积计算
活性单位定义:25℃中每毫升血清每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。
ADH (nmol/min/mL) =(△A÷ε÷d×V反总×109) ÷V样÷T
=3215×△A
ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:96孔板光径,0.5 cm;V反总:反应体系总体积,200μL=2×10-4 L;Cpr:上清液蛋白质浓度,mg/mL;W :样品质量;V样:加入反应体
BPC1102 NADH氧化酶(NOX)测定试剂盒(微量法)
BPC1103 乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒(微量法)
BPC1104 NAD-苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)测定试剂盒(微量法)
BPC1105 NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)测定试剂盒(微量法)
BPC1107 柠檬酸合酶(CS)测定试剂盒(微量法)
BPC1108 乙醇脱氢酶(ADH)测定试剂盒(微量法)
BPC1109 乙醛脱氢酶(ALDH)测定试剂盒(微量法)
BPC1110 甲醛脱氢酶(FDH)测定试剂盒(微量法)
BPC1111 乙醇含量测定试剂盒(微量法)