人白介素17a(IL-17a)ELISA Kit /Human Interleukin 17,IL-17 IL-17a ELISA Kit
- 48/96T
- 1580.00-2580.00
- 白介素17a(IL-17a),ELISA.试剂盒
- 2.5-400ng/L
- 批间差：CV＜10%
- 批内差：CV＜10%
白细胞介素 17A (IL-17A)，又称 CTLA-8，属于 IL-17 细胞因子家族。 IL-17A 在记忆 Th17细胞中表达，是记忆 CD4+ T 细胞的产物。 除了 Th17 细胞，IL-17A 也可由多种免疫细胞产生，包括 CD8+ T 细胞、γδT 细胞、自然杀伤 T (NKT) 细胞、单核细胞和中性粒细胞。 IL-17A 在宿主对抗许多细菌和真菌病原体的防御机制以及过敏和自身免疫反应中起着关键作用。 IL-17A 诱导抗菌肽 (防御素和 S100 蛋白)、细胞因子 (IL-6、G-CSF 和 GM-CSF)、趋化因子 (CXCL1、CXCL5、IL-8、CCL2 和 CCL7) 和基质金属蛋白酶 (MMP1、MMP3 和 MMP13) 的产生。IL-17A 通过促进中性粒细胞炎症在病毒感染中起作用。 IL-17A 是一种同型二聚体细胞因子，与 IL-17F 具有相似的生物学活性。 IL-17A 与 IL-17RA 具有高亲和力结合，IL-17RA 是 IL-17A 生物活性所必需的。 IL-17A 不能与缺乏 IL-17RA 的 T 细胞、B 细胞和髓细胞结合。 IL-17A 与多种自身免疫性疾病有关，如类风湿性关节炎、多发性硬化症、炎症性肠病、哮喘和牛皮癣。 IL-17A 在癌症中也起着致病作用。 在肿瘤发生过程中，IL-17A 招募骨髓源性抑制细胞 (MDSCs) 来抑制抗肿瘤免疫。 IL-17A 还通过诱导 IL-6 促进肿瘤在体内生长。 小鼠 IL-17A 是一种 21 kDa 的糖蛋白，含有 147 个氨基酸，与人类 IL-17A (155 个氨基酸)有 63% 的氨基酸同源性。
1.实验原理：
本试剂盒采用竞争法检测样本中白介素17a(IL-17a)的含量。向预先包被了抗体的酶标孔中加入样本，再加入生物素标记的识别抗原，在37℃下孵育30min，两者与固相抗体竞争结合形成免疫复合物，经PBST洗涤除去未结合的生物素抗原，然后加入亲和素-HRP，在37℃下孵育30min,亲和素-HRP与生物素抗原结合，洗涤后结合的HRP催化TMB（四甲基联苯胺）成蓝色，随后在酸的作用下转化成黄色，在450nm波长下有吸收峰，吸光值与样本中抗原的浓度成负相关
2.试剂盒组成：
试剂盒组成 | 48孔配置 | 96孔配置 | 保存 |
说明书 | 1份 | 1份 | |
封板膜 | 2片（48） | 2片（96） | |
密封袋 | 1个 | 1个 | |
酶标包被板 | 1×48 | 1×96 | 长期-20℃ |
标准品（冻干粉） | 2支（定容至150μl） | 2支（定容至150μl） | 2-8℃ |
标准品/样品稀释液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃ |
生物素抗原（冻干粉） | 1支(稀释到3ml） | 1支(稀释到6ml） | 长期-20℃ |
亲和素-HRP（浓缩液） | 50μl(稀释到3ml） | 100μl (稀释到6ml） | 长期-20℃ |
生物素抗原稀释液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃ |
亲和素-HRP稀释液 | 2.95ml×1瓶 | 5.9ml×1瓶 | 2-8℃ |
显色剂A液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃ |
显色剂B液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃ |
终止液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃ |
浓缩洗涤液 | （20ml*25倍）×1瓶 | （20ml*25倍）×1瓶 | 2-8℃ |
备注：
1) 试剂盒中“标准品/样品稀释液”为超纯水（可用双蒸水替代），“终止液”为2M的H2SO4，洗涤液为含0.15%吐温-20的PBST，如不够可自行配制。
2) 不同公司的缓冲体系存在较大差异，请勿将本试剂盒的试剂与其他公司的试剂混用以免影响实验结果。
3) 浓缩洗涤液在低温下会有少量盐类析出，稍微加温后即会消失，不影响使用。
4) 浓缩生物素抗原和浓缩亲和素-HRP稀释前务必先离心同时应避免反复冻融
3.需要而未提供的试剂和器材
1) 37℃恒温箱。 2) 标准规格酶标仪。
3) 精密移液器及一次性吸头 4) 双蒸水或超纯水
5) 干净的试管或Eppendof管 6) 吸水纸
7) 自动洗板机或8道排枪 8) ELISA数据处理软件，推荐使用ELISACalc
9) 500ml烧杯的和适当量程的量筒
4.试剂准备
1) 使用前所有试剂应置于室温平衡至少30分钟。
2) 本试剂盒可以直接加样，如浓度过高，可以进行适当比例的稀释（推荐2-5倍稀释），计算时应将结果乘以稀释的倍数。
3) 洗涤液为25倍浓缩液，使用前将所有洗涤液倒入500ml或1L的烧杯中，用双蒸水定容到500ml即为工作液。
4) 标准品的稀释：取5支干净的Eppendorf管，每管加150μl的标准品稀释液，分别标记上标准品1，标准品2，标准品3，标准品4，标准品5.取150μl标准品原液加入标记标准品1 的管中，混匀后同样取出150μl，加入下一管，以此类推直至***一管。零孔：直接加标准品/样品稀释液。（见下图）
原液 标准品1 标准品2 标准品3 标准品4 标准品5
5)生物素抗原的稀释：抽取生物素抗原稀释液1ml到浓缩型生物素抗原中，漩涡混匀15秒至冻干粉完全溶解，然后将所有液体移入稀释液瓶中,再次漩涡混匀30秒即为生物素抗原工作液。
6) 亲和素-HRP的稀释：低速离心（使浓缩液全部沉到管底），将浓缩亲和素-HRP全部移入相应稀释液中然后漩涡混匀30秒即为亲和素-HRP工作液。
5.详细操作程序
1) 使用前请先将试剂盒在室温下平衡半小时。
2) 空白孔不加样，只加显色剂A，B和终止液用于调零。
3)标准品孔：每孔加入稀释好的标准品50μl，零孔加入标准品/样品稀释液50μl，然后加入生物素抗原工作液50μl(零孔必须要做，并将其作为标曲的***一个点)。
4)样品孔：加入样品50μl（推荐直接加样，浓度高可以用样品稀释液稀释2-5倍），然后加入生物素抗原工作液50μl。
5) 轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30min。
6) 将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水25倍稀释后备用。
7) ***次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
8) 加入50μl亲和素-HRP到标准品孔和样品孔中，轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30min。
9) 第二次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
10) 显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。
11) 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色).
12) 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。
13) 计算：根据浓度和OD值算出标准曲线的回归方程，建议用专用计算软件进行计算，推荐使用ELISAcalc进行计算，拟合模型选用logistic曲线（四参数）。
