软体动物活性氧 (ROS)elisa试剂盒/Molluscs Reactive OXyen Species,ROS ELISA Kit

1.实验原理：

本试剂盒采用竞争法(间接法)检测样本中活性氧簇（reactive   oxygen   species，ROS）的含量。向预先包被了相关抗体的酶标孔中加入样本，再加入辣根过氧化物酶标记的识别抗原，在37℃下孵育1小时，两者与固相抗体竞争结合形成免疫复合物，经PBST洗涤后，结合的HRP催化TMB（四甲基联苯胺）成蓝色，随后在酸的作用下转化成黄色，在450nm波长下有吸收峰，吸光值与样本中抗原的浓度成负相关。

2.试剂盒组成：

3.试剂盒保存

本试剂盒可以在2-8℃下保存6个月，在-20℃下可以保存更长的时间。酶标板为真空包装，板条可以拆卸，拆开以后如一次不能用完，请放入提供的密封袋中，放入干燥剂，2-8℃保存，在一个月之内仍然有效。试剂不能反复冻融。

4．需要而未提供的试剂和器材

1．37℃恒温箱                        2．标准规格酶标仪。

3．精密移液器及一次性吸头   4．双蒸水或超纯水

5．干净的试管或Eppendof管  6．吸水纸

7．自动洗板机或8道排枪         8．ELISA数据处理软件，推荐使用ELISACalc

9．500ml烧杯的和适当量程的量筒

5.试剂准备

a.     使用前所有试剂应置于室温平衡至少30分钟。

b.     本试剂盒可以直接加样，如浓度过高，可以进行适当比例的稀释（推荐2-5倍稀释），计算时应将结果乘以稀释的倍数。

c.      洗涤液为25倍浓缩液，使用前将所有洗涤液倒入500ml或1L的烧杯中，用双蒸水定容到500ml即为工作液。

d.     标准品的稀释：取5支干净的Eppendorf管，每管加150μl的标准品稀释液，分别标记上4800U/ml   ,2400U/ml , 1200U/ml ,600U/ml ,300U/ml .取150μl标准品原液加入标记4800U/ml   的管中，混匀后同样取出150μl，加入下一管，以此类推直至***一管。零孔：直接加标准品/样品稀释液。（见下图）

原液9600U/ml  4800U/ml  2400U/ml  1200U/ml  600U/ml  300U/ml 

6.详细操作程序

a.     使用前请先将试剂盒在室温下平衡半小时。

b.     空白孔不加样，只加显色剂A，B和终止液用于调零。

c.      标准品孔：每孔加入稀释好的标准品50μl，零孔加入标准品/样品稀释液50μl，然后加入酶标试剂50μl。

d.     样品孔：加入样品50μl（推荐直接加样，浓度高可以用样品稀释液稀释2-5倍），然后加入酶标试剂50μl。

e.      轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育60min。

f.       将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水25倍稀释后备用。

g.     洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

h.     显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。

i.       终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

j.       测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。

k.     计算：根据浓度和OD值算出标准曲线的回归方程，建议用专用计算软件进行计算，推荐使用ELISAcalc进行计算，拟合模型选用logistic曲线（四参数）。标曲示意图如下：