人组织因子途径抑制物(TFPI)ELISA Kit Human Tissue factor pathway inhibitor,TFPI ELISA Kit

工作原理

本试剂盒采用的是生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定样品中人组织因子途径抑制因子(TFPI)的水平。向预先包被了人组织因子途径抑制因子(TFPI)单克隆抗体的酶标孔中加入组织因子途径抑制因子(TFPI)，温育；温育后，加入生物素标记的抗TFPI抗体，再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中人组织因子途径抑制因子(TFPI)的浓度呈正相关。

试剂盒组成

需要而未提供的试剂和器材：

1.   37℃恒温箱。 2. 标准规格酶标仪。3. 精密移液器及一次性吸头 4. 蒸馏水 5. 一次性试管 6. 吸水纸等

样本处理：

1.   标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

2.   血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

3.   血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

4.   尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

5.   组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

注意事项

1．   从2-8℃取出的试剂盒，在开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2．   各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。

3．   严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准。

4．   为避免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和封板膜。

5．      不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

6．      底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。

洗板方法

手工洗板方法：甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将稀释后的洗涤液至少0.35ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。

自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

标本要求

1．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

2．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融

操作程序

1．      标准品的稀释：（本试剂盒提供原倍标准品一支，用户请按照说明自行在小试管中倍比稀释）：

2．      根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3．      加样：1）空白孔：空白对照孔不加样品，生物素标记的抗TFPI抗体，链霉亲和素-HRP，只加显色剂A&B和终止液，其余各步操作相同；2）标准品孔：加入标准品50μl，链霉素-HRP50μl（标准品中已事先整合好生物素抗体，故不加）；3)待测样品孔:加入样本40μl，然后各加入抗- TFPI抗体10μl、链酶亲和素-HRP50μl，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃温育60分钟。

4．      配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

5．      洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6．      显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。

7．      终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

8．      测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。

9.根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种应用软件来计算。