人抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)ELISA Kit /Human tartrate-resistant acid phosphatase 5b,TRACP-5b ELISA Kit
- 48/96T
- 1380.00-2580.00
- TRACP-5b,试剂盒，ELISA
- 0.05-12U/L
- 批间差：CV＜12%
- 批内差：CV＜10%
抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP) 为最近发现的骨吸收和破骨细胞活性的良好标志物, 测定血清中TRACP 尤其是TRACP-5b 的浓度, 有助于了解生理条件和各种病理条件下的骨代谢状况。TRAP主要存在于巨噬细胞、破骨细胞、Gaucher 细胞、红细胞、血小板、脾脏毛状细胞以及单核吞噬细胞中, 但在肺泡巨噬细胞和破骨细胞中含量最丰富,而单核细胞的前体则不含TRAP。在正常人血清中, TRAP 以两种不同的糖基化形式存在, 即TRAP - 5a和TRAP- 5b, 其中TRAP - 5a主要来源于炎性巨噬细胞, 而TRAP - 5b则主要来源于破骨细胞。TRAP-5a可以在唾液酸酶作用下转变为TRAP - 5b。纯化的人破骨细胞的TRAP 是TRAP - 5b, 不含唾液酸残基, 而TRAP - 5a含有唾液酸残基。TRAP - 5b与总TRAP 的活性有强烈的相关性, 表明总TRAP活性大部分为破骨细胞来源的TRACP - 5b所体现。
1.实验原理：
本试剂盒采用竞争法检测样本中抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)的含量。向预先包被了抗体的酶标孔中加入样本，再加入生物素标记的识别抗原，在37℃下孵育30min，两者与固相抗体竞争结合形成免疫复合物，经PBST洗涤除去未结合的生物素抗原，然后加入亲和素-HRP，在37℃下孵育30min,亲和素-HRP与生物素抗原结合，洗涤后结合的HRP催化TMB（四甲基联苯胺）成蓝色，随后在酸的作用下转化成黄色，在450nm波长下有吸收峰，吸光值与样本中抗原的浓度成负相关
2.试剂盒组成：
试剂盒组成 | 48孔配置 | 96孔配置 | 保存 |
说明书 | 1份 | 1份 | |
封板膜 | 2片（48） | 2片（96） | |
密封袋 | 1个 | 1个 | |
酶标包被板 | 1×48 | 1×96 | 长期-20℃ |
标准品（冻干粉） | 2支（定容至150μl） | 2支（定容至150μl） | 2-8℃ |
标准品/样品稀释液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃ |
生物素抗原（冻干粉） | 1支(稀释到3ml） | 1支(稀释到6ml） | 长期-20℃ |
亲和素-HRP（浓缩液） | 50μl(稀释到3ml） | 100μl (稀释到6ml） | 长期-20℃ |
生物素抗原稀释液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃ |
亲和素-HRP稀释液 | 2.95ml×1瓶 | 5.9ml×1瓶 | 2-8℃ |
显色剂A液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃ |
显色剂B液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃ |
终止液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃ |
浓缩洗涤液 | （20ml*25倍）×1瓶 | （20ml*25倍）×1瓶 | 2-8℃ |
备注：
1) 试剂盒中“标准品/样品稀释液”为超纯水（可用双蒸水替代），“终止液”为2M的H2SO4，洗涤液为含0.15%吐温-20的PBST，如不够可自行配制。
2) 不同公司的缓冲体系存在较大差异，请勿将本试剂盒的试剂与其他公司的试剂混用以免影响实验结果。
3) 浓缩洗涤液在低温下会有少量盐类析出，稍微加温后即会消失，不影响使用。
4) 浓缩生物素抗原和浓缩亲和素-HRP稀释前务必先离心同时应避免反复冻融
3.需要而未提供的试剂和器材
1) 37℃恒温箱。 2) 标准规格酶标仪。
3) 精密移液器及一次性吸头 4) 双蒸水或超纯水
5) 干净的试管或Eppendof管 6) 吸水纸
7) 自动洗板机或8道排枪 8) ELISA数据处理软件，推荐使用ELISACalc
9) 500ml烧杯的和适当量程的量筒
4.试剂准备
1) 使用前所有试剂应置于室温平衡至少30分钟。
2) 本试剂盒可以直接加样，如浓度过高，可以进行适当比例的稀释（推荐2-5倍稀释），计算时应将结果乘以稀释的倍数。
3) 洗涤液为25倍浓缩液，使用前将所有洗涤液倒入500ml或1L的烧杯中，用双蒸水定容到500ml即为工作液。
4) 标准品的稀释：取5支干净的Eppendorf管，每管加150μl的标准品稀释液，分别标记上标准品1，标准品2，标准品3，标准品4，标准品5.取150μl标准品原液加入标记标准品1 的管中，混匀后同样取出150μl，加入下一管，以此类推直至***一管。零孔：直接加标准品/样品稀释液。（见下图）
原液 标准品1 标准品2 标准品3 标准品4 标准品5
5)生物素抗原的稀释：抽取生物素抗原稀释液1ml到浓缩型生物素抗原中，漩涡混匀15秒至冻干粉完全溶解，然后将所有液体移入稀释液瓶中,再次漩涡混匀30秒即为生物素抗原工作液。
6) 亲和素-HRP的稀释：低速离心（使浓缩液全部沉到管底），将浓缩亲和素-HRP全部移入相应稀释液中然后漩涡混匀30秒即为亲和素-HRP工作液。
5.详细操作程序
1) 使用前请先将试剂盒在室温下平衡半小时。
2) 空白孔不加样，只加显色剂A，B和终止液用于调零。
3)标准品孔：每孔加入稀释好的标准品50μl，零孔加入标准品/样品稀释液50μl，然后加入生物素抗原工作液50μl(零孔必须要做，并将其作为标曲的***一个点)。
4)样品孔：加入样品50μl（推荐直接加样，浓度高可以用样品稀释液稀释2-5倍），然后加入生物素抗原工作液50μl。
5) 轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30min。
6) 将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水25倍稀释后备用。
7) ***次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
8) 加入50μl亲和素-HRP到标准品孔和样品孔中，轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30min。
9) 第二次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
10) 显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。
11) 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色).
12) 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。
13) 计算：根据浓度和OD值算出标准曲线的回归方程，建议用专用计算软件进行计算，推荐使用ELISAcalc进行计算，拟合模型选用logistic曲线（四参数）。
