1.原理
糖化血红蛋白经酸化水解后生成5-羟甲基糠醛(5-HMF),后者与2-硫代巴比妥钠反应,生成的产物在443nm下有吸收峰,以此反映糖化血红蛋白的含量。
2.测定意义
糖化血红蛋白目前用作反映糖尿病患得到血糖在一段较长时间内(4-10)周的控制指标,血糖长期控制不良的,其糖化血红蛋白就会升高,因此糖化血红蛋白测定有助于控制,对糖尿病的周围血管和心血管并发症的研究有重要作用。
3.测试所需仪器设备及自备试剂
可见光分光光度计,恒温水浴锅,离心机, 漩涡混匀器,精密移液器,试管,双蒸水,生理盐水。
4.适用范围
本试剂盒可测定动物血细胞、全血等样本中糖化血红蛋白(GHbA1C)的含量。
5.试剂及配置
试剂 | 50T |
标准品 | 5-羟甲基糠醛(5-HMF),粉剂,用时加双蒸水5ml充分溶解即为标准品工作液 |
试剂1 | 酸化试剂,25m*1瓶 |
试剂2 | 蛋白沉淀剂,25m*1瓶 |
试剂3 | 显色剂,0.18g*1支,用时以25ml双蒸水,可适当加热至60-70℃以促进溶解,加热溶解后用双蒸水补足到25ml即为试剂3工作液。配好后注意避光保存,一周内用完。 |
试剂4 | 65ml*2瓶,用于测定溶血液的Hb含量 |
6.操作步骤
(1)红细胞洗涤:
取EDTA或肝素钠抗凝全血2-4ml至于带刻度离心管中,以500-1000r/min,离心5-10min,弃上清留沉淀的红细胞,然后用生理盐水洗涤2-3次。
(2)溶血液的制备:
①取压积红细胞1ml加冷双蒸水1.5ml,用手剧烈震摇数分钟,货漩涡混匀器充分混匀1min制得溶血液,此溶血液-20℃保存可放置70天。
②溶血液的血红蛋白(Hb)浓度测定方法如下:
取溶血液10μl加试剂4 2.5ml,混匀,室温放置10min,用分光光度计在540nm处,1cm光径,蒸馏水调零测定各管吸光值,将所得吸光值*0.3677即为Hb的含量g/ml。
(3)酸化
试剂(ml) | 空白管 | 测定管 |
溶血液 |
| 0.2 |
双蒸水 | 1 | 0.8 |
试剂1 | 0.5 | 0.5 |
摇匀后,用保鲜膜扎紧试管口,在保鲜膜上刺一小口,沸水浴1小时酸化
3000r/min离心5min,吸取上清液1.5ml进行下一步显色反应
(4)显色
试剂(ml) | 空白管 | 标准管 | 测定管 |
标准品应用液(30nmol/L) |
| 1 |
|
试剂2 |
| 0.5 |
|
上清 | 1.5 |
| 1.5 |
试剂3 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
40℃水浴30min,再置室温冷却15min,于443nm处,双蒸水调零,1cm光径,测定各管吸光值
(1)空白管和标准管只要测一次。
(2)试剂1加入一定要缓慢,边滴边摇边加入。
(3)试剂3对皮肤有刺激性,如不小心碰到皮肤或衣物请用大量清水冲洗。